維生素B6生物傳感器對人體液中鋁形態(tài)的研究

摘要：采用維生素B6(VB6)修飾玻碳電極生物傳感器，對生物樣品中的鋁形態(tài)用示差脈沖伏安法進(jìn)行了測定。VB6的氧化峰電流隨著加入鋁濃度的增加而下降，而峰電位不變。本文形態(tài)分析的方法是建立在兩個(gè)pH條件下VB6對鋁的配位能力不同的基礎(chǔ)上的。對其應(yīng)用于鋁形態(tài)區(qū)分的機(jī)理從文獻(xiàn)和模擬計(jì)算進(jìn)行了探討。這種靈敏、簡單的形態(tài)分析方法成功地應(yīng)用于對人血清，腦脊液等體液中鋁形態(tài)分析，并與超濾、滲析等方法進(jìn)行比較，結(jié)果一致。與其它形態(tài)分析技術(shù)相比，本法具有高靈敏度、儀器便宜、操作簡單和測定快速等優(yōu)點(diǎn)。
關(guān)鍵詞：鋁；兒茶酚類；形態(tài)分析；示差脈沖伏安法；人體液
中圖分類號：O657.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

一、前言

微量元素在生物體中的作用，尤其是對人體健康的影響是當(dāng)前生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)科研工作者研究的熱門交叉課題[1~7]。鋁被公認(rèn)對人體具有毒性，其致毒機(jī)理雖然還不清楚，但是大量的證據(jù)表明鋁與某些疾病相關(guān)聯(lián)，比如阿爾滋海默氏癥、帕金森氏癥、糖尿病、癌癥等[3,6]。然而鋁的生物有效性和毒性依賴于它在溶液中的形態(tài)分布[3,4,8]。在各種鋁存在形態(tài)中，正電荷的水合鋁離子（[Al(H2O)6]3+），羥基鋁（[Al(OH)(H2O)5]2+，[Al(OH)2(H2O)4]+等）被認(rèn)為最具毒性，而有機(jī)結(jié)合態(tài)的鋁一般被認(rèn)為是無毒的形態(tài)[7-15]。人體中吸收的鋁是通過血液傳輸?shù)摹Ｑ迨且粋€(gè)十分復(fù)雜的混合物，它的組成包括脂類(脂蛋白)、蛋白質(zhì)（例如免疫球蛋白、白蛋白和鐵轉(zhuǎn)移蛋白）、小分子，還有一些離子等等[11]。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道鋁在血清中的主要形態(tài)是Al-去鐵胺和Al－鐵蛋白[8,9]。其它諸如白蛋白的可能結(jié)合鋁的大分子量(HMM)的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是非常弱的金屬離子配位體，不足以競爭結(jié)合一定數(shù)量的鋁[16,17]。對于小分子量(LMM)的配體來說，檸檬酸和磷酸是最重要的。氨基酸、乳酸、草酸，及其它無機(jī)陰離子都競爭不過檸檬酸與磷酸[16]。

因此，研究鋁在人體中的結(jié)合形態(tài)、對其生理作用，對人類健康的影響和采取有效的預(yù)防措施來保護(hù)人類健康及開發(fā)相應(yīng)的治療藥物具有重要意義。

鋁離子形態(tài)分析方法可以被分為四類[18]：（1）基于化學(xué)模型的熱力學(xué)平衡計(jì)算。（2）基于分析試劑與各種鋁形態(tài)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的差異進(jìn)行分離分析。（3）直接光譜測定技術(shù)，如核磁共振（NMR）。最廣泛應(yīng)用的是27Al-NMR。（4）聯(lián)用技術(shù)，先是進(jìn)行有效的分離（超濾、滲析），接著光譜測定。近十年來，此法在生物體液鋁形態(tài)分析中占據(jù)了重要地位。但是，譜學(xué)技術(shù)的儀器昂貴，形態(tài)分析操作過程繁雜，易引入污染物，核磁共振的靈敏度較低，不能應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析中，而超濾、滲析則因操作問題會帶來較大誤差。近年來，電化學(xué)方法由于靈敏度高、操作方便和儀器便宜等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于鋁的形態(tài)分析[3,4]。我們實(shí)驗(yàn)室采用一系列試劑用于電化學(xué)Al形態(tài)區(qū)分，并與經(jīng)典的Driscoll方法比較，獲得了滿意的結(jié)果[8-14]。研究中我們發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，選擇適當(dāng)試劑可以在pH4~5酸性區(qū)間測定無機(jī)單核鋁，此時(shí)絕大部分無機(jī)單核鋁組分均被分析試劑奪取，但是，有機(jī)結(jié)合鋁形態(tài)仍然很穩(wěn)定，能夠抵抗來自分析試劑的競爭配位。而在pH8~9堿性條件下，分析試劑具有足夠強(qiáng)的配位能力，不僅能從無機(jī)單核鋁，而且可以從幾乎所有有機(jī)結(jié)合態(tài)鋁中把鋁奪取出來，從而測定總單核鋁。再用ICP測定總鋁，減去單核鋁濃度可以獲得聚合多核鋁濃度，由此進(jìn)行天然水體和體液中鋁形態(tài)區(qū)分[13,14]。

我們選擇了維生素B6(VB6)來測定鋁，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。VB6其化學(xué)成分為鹽酸吡哆醇，是一種常見的營養(yǎng)藥。VB6在體內(nèi)參與氨基酸代謝、促進(jìn)氨基酸的吸收和蛋白質(zhì)的合成、參與血紅素的合成等。VB6在臨床上也有許多用途。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鋁與VB6會發(fā)生配位，這樣抑制了它們的氧化。這就是VB6電化學(xué)方法測定鋁的理論基礎(chǔ)，由此建立了VB6示差脈沖伏安法，對生物樣品中的鋁形態(tài)分析進(jìn)行了分析，并與超濾、滲析等方法進(jìn)行了比較，結(jié)果令人滿意。與其它形態(tài)分析技術(shù)相比，電化學(xué)具有高靈敏度、儀器便宜、操作簡單和測定快速等優(yōu)點(diǎn)。

二、實(shí)驗(yàn)部分

1、儀器

三電極系統(tǒng)：玻碳電極為工作電極，鉑片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。分析測定在美國BAS公司的BAS-100電分析儀上進(jìn)行。示差脈沖伏安參數(shù)為：掃速20mV/s，脈沖幅度50mV，脈沖寬度60ms。79-1型磁力加熱攪拌器（國華儀器廠）。PXD-12型數(shù)字式離子計(jì)（江蘇電分析儀器廠）。超濾裝置是Amicon公司的Stirred Ultrafiltration Cells (Model 8200)，超濾膜的截留分子量為10000。透析袋的截留分子量為10000。處理方法為在2%的NaHCO3，10-2M的Na2EDTA溶液中煮沸10min，清洗，再用去離子水煮沸[16]。

2、試劑

7.6×10-3M的維生素B6（99%，瑞士Acros Organics公司）儲備液， 0.02M的鋁儲備液由高純鋁粉溶于適量濃鹽酸，稀釋成100ml，使用時(shí)再稀釋。緩沖溶液：pH3.6~5.4由NaAc和HAc按適當(dāng)比例配制，pH7.8~9.2由NH4Cl和NH3·H2O按適當(dāng)比例配制。支持電解質(zhì)為0.15MNaCl。實(shí)際樣品包括血清（南京紅十字血液中心提供）和腦脊液（中大醫(yī)院提供）。所用化學(xué)試劑除特別說明外均為分析純。實(shí)驗(yàn)器皿使用前在1:10硝酸浸泡24h后再用自來水、蒸餾水和二次蒸餾水依次洗凈。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

3、實(shí)驗(yàn)步驟

用細(xì)砂紙濕磨拋光玻碳電極，再用濕吸水紙輕擦，然后分別在0.1 M鹽酸溶液和蒸餾水中超聲洗滌5min。在-0.30到1.00V以100mV/s的速度掃循環(huán)伏安圖，直到電流處于穩(wěn)定狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將50 ml試液置于三電極系統(tǒng)，記錄試劑示差脈沖氧化峰電流，以100 mV/s線性掃描反掃清洗電極。每注射一次鋁溶液電磁攪拌5min，靜置1 min后記錄示差脈沖氧化峰電流。在N2氣氛保護(hù)下實(shí)驗(yàn)。

平衡透析是裝有5ml血清的透析袋懸浮在裝有495ml二次蒸餾水的燒杯中24h，并且溶液被攪拌以加快平衡時(shí)間，然后用ICP-AES檢測鋁濃度。

三、結(jié)果與討論

1、測定溶液中鋁濃度方法的建立

（1）VB6的DPV圖

圖2為VB6分別在酸性和堿性兩個(gè)pH條件下無鋁和有鋁時(shí)的DPV響應(yīng)圖。在研究電位區(qū)間，底液的電化學(xué)響應(yīng)是較平坦的曲線。加入VB6試劑后，出現(xiàn)一DPV氧化峰，堿性時(shí)的峰電位均比酸性時(shí)的峰電位負(fù)。加入鋁后，峰電位不變，峰電流下降，且峰電流隨加入鋁濃度的增加呈線性下降。這是本方法的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

（2）測定條件的優(yōu)化

鋁形態(tài)的分布及鋁-VB6配合物的形成與pH值的變化都有很大的關(guān)系。因此，pH值是測定鋁的一個(gè)非常重要的因素。pH值的影響見圖3（a,b）。從圖中可以看出，ΔIp在酸性和堿性區(qū)間的現(xiàn)象相同，先是隨pH增大而增加，然后分別在pH4.6、8.5處達(dá)到最大值，而后隨pH繼續(xù)增大而減小。VB6的濃度往往與測定的線性范圍及檢測限有很大關(guān)系。緩沖液的濃度也會影響測定的靈敏度。圖3(c,d)，(e,f)分別顯示了這兩種因素的影響。實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的結(jié)果在表1中列出。

2、線性范圍、檢測下限和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在上述最佳測定條件下，對線性范圍、檢測限和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別進(jìn)行了測定（見表2）。

3、體液中鋁形態(tài)分析

（1）SPE模擬計(jì)算的結(jié)果

采用SPE程序[17]對血清模型計(jì)算鋁形態(tài)分布，我們只考慮小分子量配體，忽略大分子量配體。由前人的工作得知，檸檬酸、磷酸是鋁的最主要的小分子量配體，故血液模型中只加入了這兩種物質(zhì)。平衡常數(shù)來自文獻(xiàn)[17]，見表3。選取VB6加入到模擬血液的體系中來進(jìn)行計(jì)算。忽略了可能存在的混配情況，以及離子強(qiáng)度對形態(tài)分布的影響，結(jié)果見圖4。其中縱坐標(biāo)代表物種濃度占總鋁濃度的百分?jǐn)?shù)。從中我們可以看出，pH=4.0~5.0時(shí)，Al3+-檸檬酸根配合物占總鋁濃度的大部分。PH=8.5時(shí)，VB6從檸檬酸配合物和四羥基鋁離子中幾乎奪取了全部的鋁離子，形成1:3的配合物。這就從熱力學(xué)上證明了VB6可用來進(jìn)行對血液中鋁形態(tài)區(qū)分。

（2）實(shí)際體液中的鋁形態(tài)測定

血清的成分種類很復(fù)雜，在測定鋁之前，我們先選擇了一系列相關(guān)的生物小分子和離子做干擾實(shí)驗(yàn)。酸性條件下，主要干擾為Fe3+、Fe2+、Mn2+、Cu2+（1~5倍）。然而體液中大部分陽離子自由態(tài)濃度遠(yuǎn)低于鋁濃度，F(xiàn)e、Mn、Cu主要處于配位狀態(tài)，這將減輕它們的干擾。例如，在生理pH自由態(tài)的鐵濃度比鋁的自由態(tài)濃度低七個(gè)數(shù)量級[11]，大量的鐵被鐵蛋白和鐵轉(zhuǎn)移蛋白結(jié)合[2]。其它無機(jī)離子的干擾情況為：Pb2+(10~20倍)，Ca2+和Mg2+（100~200倍），Ni2+、Li+和PO43-（200~500倍），F(xiàn)-(1000倍)，這些離子在體液中的濃度遠(yuǎn)低于干擾臨界值，對本文鋁形態(tài)分析無干擾。大量的Na+、K+、NH4+、 NO3-、Cl-不干擾。有機(jī)物質(zhì)的干擾情況為：EDTA、脲酸、磺基水楊酸、半胱氨酸（5~10倍），精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸（50~100倍），抗壞血酸、檸檬酸、脲素、琥珀酸、谷氨酸（200~500倍），草酸、葡萄糖、酒石酸、乳酸(>1000倍)。堿性條件下，陽離子的干擾變化不大，有機(jī)物質(zhì)的干擾則明顯減輕。EDTA、脲酸、磺基水楊酸、半胱氨酸（20~50倍），精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸（200~500倍），抗壞血酸、檸檬酸、脲素、琥珀酸、谷氨酸(>1000倍)。

為什么不同pH條件下，各種配體的干擾倍數(shù)會又如此大的差異？問題的答案在于鋁－VB6配合物同鋁檸檬酸根配合物的穩(wěn)定常數(shù)對pH的不同依賴關(guān)系造成的。在酸性條件下，有機(jī)配體表現(xiàn)出比VB6更強(qiáng)的配位結(jié)合能力。因此VB6只能奪取自由鋁，羥基鋁、硫酸根、硅酸根以及氟離子的配合物以及一小部分不穩(wěn)定有機(jī)配合物中的鋁離子。但是，在堿性條件下，VB6具有比檸檬酸等配體更強(qiáng)的配位能力。因此，VB6不僅能奪取無機(jī)單核鋁，而且也可以從有機(jī)結(jié)合態(tài)鋁中把鋁奪取出來，在這樣的條件下，測定的鋁形態(tài)是總單核鋁組分。這也從另一方面驗(yàn)證了我們的兩個(gè)pH條件下鋁形態(tài)區(qū)分思想。

用VB6分別在酸性和堿性條件下，對五個(gè)健康人的血清進(jìn)行了鋁的測定，并同超濾、滲析方法進(jìn)行了比較，結(jié)果見表4。

血清是一個(gè)復(fù)雜的混合物，包括脂類、蛋白質(zhì)、小分子和一些無機(jī)離子等，但其中鋁的真正有效配體并不多。大分子量的主要是鐵轉(zhuǎn)移蛋白，并且可能是唯一結(jié)合鋁的蛋白質(zhì)。它結(jié)合了血清中絕大部分的鋁，大約占總鋁的80%~90%[13，14]。在小分子量的配體中，檸檬酸和磷酸占據(jù)了主要地位，兩者結(jié)合了大約總鋁的10%~20%。VB6法在堿性條件下測的是總單核鋁，酸性條件下測的是無機(jī)單核鋁。也就是說，堿性條件下測定的鋁對應(yīng)的是小分子量配體結(jié)合的鋁。從表4中可以看出，測定的總單核鋁占總鋁的大約15%左右，與前人工作的結(jié)果基本吻合[2,18]。

同時(shí)，這部分結(jié)果還與超濾、滲析的結(jié)果進(jìn)行了比較。在血清鋁形態(tài)的分析方法中，超濾、滲析也占據(jù)了一定地位。超濾、滲析是運(yùn)用物理的手段，利用配體之間的分子量差別對鋁形態(tài)進(jìn)行粗分，形成了high molecular weight(HMW)和low molecular weight(LMW)兩部分。由于血清中大分子配體與小分子配體之間的分子量差別較大，故文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果也比較一致，LMW占據(jù)了總鋁的10%~20%[2]，與用其他方法得到的結(jié)果吻合。從表4中可以看出，我們做的超濾與滲析的結(jié)果比較接近，均占總鋁的15%~20%，與文獻(xiàn)報(bào)道值一致[2,9]。六種試劑測定的總單核鋁與之比較，結(jié)果吻合。這也說明了VB6可以用電化學(xué)的方法對血清中的鋁形態(tài)進(jìn)行粗分。

對于小分子量的配體，是檸檬酸占據(jù)主要地位，還是磷酸結(jié)合了大部分的鋁，存在兩種觀點(diǎn)。Ohman[20]等人認(rèn)為檸檬酸是唯一的小分子量配體。Kiss[17]的工作則表明兩者在小分子量配體的部分中都有貢獻(xiàn)。我們測定的無機(jī)單核鋁變化較大，占總鋁的5%~15%。這個(gè)結(jié)果符合Polak[19]的觀點(diǎn)，他認(rèn)為這部分的鋁形態(tài)隨著不同的個(gè)體變化較大。我們還對腦脊液中的鋁進(jìn)行了測定，結(jié)果見表4。由于鐵轉(zhuǎn)移蛋白在腦脊液中的濃度非常的低[8]，因此Al-鐵轉(zhuǎn)移蛋白配合物在腦脊液中不存在，這一點(diǎn)與血清中的情況不同。堿性條件下我們得到的結(jié)果與ICP-AES的結(jié)果基本一致。這說明腦脊液中沒有含有什么強(qiáng)的配體。

四、結(jié)論

鋁的化學(xué)形態(tài)與它的生物效應(yīng)密切相關(guān)。在本文中，我們建立了一種新型的利用VB6作為電化學(xué)配體間接對鋁進(jìn)行形態(tài)區(qū)分的方法，并且將之成功的應(yīng)用于體液中Al形態(tài)，區(qū)分原理是基于VB6和有機(jī)配體在不同的pH條件下對鋁離子不同的配位競爭能力。在堿性的條件下，從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度有利于Al-VB6配合物的形成，可以測定總單核鋁。而在酸性的條件下，有機(jī)配體，如檸檬酸根，體現(xiàn)出對鋁離子更強(qiáng)的配位能力，結(jié)果測定的是無機(jī)單核鋁部分。該法開拓了一種新的對體液中鋁形態(tài)區(qū)分的思想。本法采用VB6作為測定配體，VB6作為營養(yǎng)藥，具有很好的生物相容性。本法進(jìn)一步的改進(jìn)成熟，對其機(jī)理進(jìn)一步的量化考察，可以更好的發(fā)展成為一種靈敏的形態(tài)區(qū)分手段，并且結(jié)合微電極技術(shù)，也許能夠?qū)崿F(xiàn)對活體進(jìn)行鋁形態(tài)分析測定。