激光掃描共聚焦顯微鏡系統應用

　　激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫學圖象儀器的最重要發展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發熒光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。已廣泛應用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經生物學等領域，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優越性，為這些領域新一代強有力的研究工具。

　　創建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項具有劃時代的義意的高科技產品，曾獲得美國“政府新產品獎”和兩次“高科技領先技術獎”，它能達到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器。現以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統及其在細胞生物學中的應用。

　　1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成

　　有關共聚焦顯微鏡的某些技術原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡，1985年WijnaendtsVanResandt發表了第一篇有關激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學中應用的文章，到了1987年，才發展成現在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。

　　激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發出的激光束經過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉90度，經過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質在激光的激發下發射沿各個方向的熒光，一部分熒光經過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。

只有在物鏡的焦平面上發出的熒光才夠到達檢測器，其它位置發出的光均不能過針孔。由于物鏡和會聚透鏡的焦點在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過程中針孔起著關鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和分辨率有重要的影響。

　　ACASULTIMa312采用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點掃描成像，由于樣品中不同的掃描點始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個樣品，掃描精度達0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當激光逐點掃描樣品時，針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，并將之轉化為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進馬達控制栽物臺的升降，使焦平面依次位于標本的不同層面上，可以逐層獲得標本相應的光學橫斷面的圖像。這稱為“光學切片”。再利用計算機的圖像處理及三維重建軟件。可以得到高清晰度來表現標本的外形剖面，十分靈活、直觀地進行形態學觀察。